一、高效高效液相色谱法概述

高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatogra：phy，液相HPLC）是色谱20世纪60年代末期，在经典液相柱色谱的高效基础上，引入了气相色谱的液相理论和技术，并加以改进而发展起来的色谱新型高效分离分析技术。它是高效指流动相为液体的色谱技术，采用高压泵、液相小颗粒高效固定相和高灵敏度检测器，色谱实现了分析速度快、高效分离效率高和操作自动化。液相高压是色谱高效液相色谱法的突出特点，系统内压力可达15～35MPa。高效由于流动相流经色谱柱时，液相柱内填料细密，色谱受到阻力很大，为使流动相携带组分迅速通过色谱柱，进入检测室，就必须对流动相施以高压。由于化学键合固定相的出现，使高效液相色谱柱效能、分离效率大大提高。

高效液相色谱法是农药残留分析不可缺少的手段。高效液相色谱仪也是农药残留分析实验室必备的仪器设备之一。它解决了热稳定性差、难于气化、极性强的农药残留分析问题，随着高灵敏、通用型检测器的成功开发及应用，能胜任绝大多数农药残留分析任务。

（一）高效液相色谱法的特点

1、高效：由于使用了细粒度的高效填充柱和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效能一般可达每米10“理论塔板数。商品化的还有微型填充柱（内径为lmm）和毛细管液相色谱柱（内径为0．05mm），柱效能超过了每米10。理论塔板数，能够实现极为有效的分离。

2、高速：由于使用高压泵输送流动相、采用梯度洗脱装置、用检测器在柱后直接检测

洗出液成分等原因，高效液相色谱法完成分离分析的时间只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法要快得多。

3、高灵敏度：紫外线、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使其灵敏度与气相色谱（GC）相接近。

4、高度自动化：先进的高效液相色谱仪配有计算机，不仅能够自动处理数据、打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相、流速、柱温、检测器波长的选择，以及进样、梯度洗脱方式等进行程序控制，成为全自动化的仪器设备。

5、不受分析试样挥发性和相对分子质量的限制：可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的农药残留及其代谢物的检测。

一般来讲，高效液相色谱法的不足是比气相色谱法分析成本高（流动相、光源灯、色谱柱的消耗）、故障率高，工效也稍低。

（二）高效液相色谱法的基本类型

液相色谱法主要分为2种类型：平面色谱（薄层色谱、纸色谱）和柱色谱。柱色谱可分为经典柱色谱（低压）和高效液相色谱（高压）。高效液相色谱法又可分为液固吸附色谱法（1iquidsolidadsrptionchromatogtaphy，LSC）、液液分配色谱法（1iquid-liquidpartitionchromatography，LLC）【主要是键合相色谱法（bonded-phasechromatography，BPC）】、离子交换色谱法（ion-excharlgechromatogry，IEC）、空间排阻色谱法（spatialexclLlSlOnchromatography，SEC）。与经典的柱色谱法不同，高效液相色谱法采用高压泵、填充微粒固定相的短柱，并且随着组分的流出检测器产生信号并记录下来。高效液相色谱法原理与经典的柱色谱法相同，它的进步主要依赖于色谱仪硬件的开发。高压泵能保证当压力不断升高的情况下，流量的精度没有变化，同时有大量的各种类型和规格的色谱柱供选用。

高效液相色谱法分离模式可分为4种基本形式。建立农药残留分析的高效液相色谱方法，选用哪种分离模式取决于农药的化学分子结构、性质以及对样品中所含有的干扰物质的分离。一般地，高效液相色谱法分析测定农药残留量以液液分配色谱的键合相色谱法最为常用。根据固定相和流动相相对极性有2种操作方式，一种是正相色谱法（normal—phasechromatography，NPC），另一种是反相色谱法（reverse—phasechromatogra—phv，RPC）。正相色谱法的固定相极性比流动相大，非极性组分先流出色谱柱；随着流动相极性的提高，被分析的组分保留时间缩短。正相色谱法的优点是调节分离选择性时溶剂选择范围宽，由于经常使用低黏度溶剂，柱压低，可得到更好的谱图；其缺点是在某些情况下，流动相配比比例悬殊，平衡时问较长，重现性差，流动相中低浓度的极性污染物会影响分析的灵敏度。

反相色谱法的固定相极性比流动相小。绝大多数极性组分先流出，随着流动相极性的增加，被分析的组分保留时间延长。反相高效液相色谱法是农药残留分析最常用的一种操作方式。

1、液固吸附色谱法：液固吸附色谱法的流动相为液体，固定相为吸附剂。固定相（常用硅胶）通常为没有包裹固定液的液相色谱法。样品中各组分因对固定相表面吸附作用的差异，得以分离和分析。色谱柱内充填固体吸附剂，利用吸附剂表面活性中心进行吸附，试样不进入固定相内部。流动相带着被测组分进入色谱柱时，吸附剂不仅对不同的组分具有不同的吸附力，而且对流动相分子也具有一定的吸附作用，在吸附剂表面各组分分子之间及各组分分子与流动相分子之间发生吸附竞争，保留值由这两个因素决定。

液固吸附色谱法的特点：适合可溶于有机溶剂的非离子型化合物的分离，特别是异构体及具有不同极性的取代基的化合物分离；适合于分析非极性和中性化合物，极性化合物可能在色谱柱上产生不可逆的吸附；分析结果重复性差，柱稳定性不好；样品组分吸附在吸附剂的活性部位有变质和损失的可能。这种方法在农药残留分析上较少应用。

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